Из грамоты короля Сигизмунда II Августа, данной 17 мая 1566 года киевскому воеводе, князю Острожскому, известно, что «Киевский девичий Флоровский монастырь на Подоле предоставляется со всем тем, что он имел, в потомственное владение или заведывание киевскому протопопу Иакову Гулькевичу, возобновившему этот монастырь, с правом совершения в нём богослужений ему самому, его детям и потомкам, какие годны быть священниками».
В официальной росписи Киева, составленной в 1682 году, упоминается женский монастырь на Подоле с двумя деревянными церквями, — одна во имя святого мученика Флора, а другая во имя святого мученика Лавра.
Вскоре после передачи монастыря в ведение киевскому протопопу Иакову Гулькевичу церковь и прочие монастырские постройки обветшали и были обновлены при митрополите Петре Могиле. Финансовое положение Флоровского монастыря оставалось бедственным вплоть до XVIII века. В 1712 году русский царь Пётр I закрывает женский Вознесенский монастырь, стоявший на Печерской горе, так как место потребовалось под постройку арсенала. Насельницы Вознесенского монастыря были переведены на Подол, во Флоровский монастырь. Флоровскому монастырю перешло и все многочисленные имения закрытого Вознесенского монастыря. Вскоре после присоединения на территории Флоровского монастыря начинается строительство новой, каменной церкви во имя Вознесения Господня, которая была освящена 2 мая 1732 года митрополитом Рафаилом Заборовским. После этого монастырь стал называться Свято-Вознесенским Флоровским.
До 1811 года, кроме каменной церкви Вознесения Господня, все остальные постройки монастыря были деревянными и сгорели в пожаре 1811 года, уничтожившим весь Подол. Во время пожара монахини переносили в каменный храм своё имущество, пытаясь спасти от пожара, при этом 40 инокинь задохнулись от дыма.
На возобновление монастыря в 1812 году, по повелению императора Александра I, было отпущено из казны 133 013 рубля ассигнациями. На эти деньги было возведено множество построек для жительства монахинь, а с 1818 года началось строительство каменных построек.
Весь XVIII и XIX века монастырь активно расширялся и застраивался, и к началу XX века почти вся доступная ровная площадь, занимаемая монастырём, оказалась застроена каменными постройками, а весь восточный склон Замковой горы — деревянными постройками.
Кроме сохранившегося после пожара 1811 года Вознесенского храма к 1917 году в монастыре было ещё четыре — церковь во имя Воскресения Господа, тёплый Трапезный храм во имя святого Николая и надстроенный над ним холодный храм во имя иконы Тихвинской иконы Богоматери, храм во имя иконы Казанской Богоматери и кладбищенская церковь на вершине Замковой горы во имя святой Троицы. Кроме того, с конца XIX века, на территории монастыря существовали богадельня, к 1918 году в ней на полном монастырском обеспечении находились 100 человек и больница. Всех зданий каменных и деревянных к 1918 году было 38.
В 1929 году монастырь был закрыт. В 1934 году был разрушен храм Святой Троицы на монастырском кладбище. Монастырь возродился в 1941 году, когда в Киев вошли немцы и с тех пор больше не закрывался, хотя и продолжал подвергаться советскими властями различным притеснениям. В 1960 году Казанский храм был перестроен под пошивочный цех, в Воскресенском и Трапезном храмах расположилась мастерская объединения «Укрреставрация». У монастыря были отобраны многие келейные корпуса, в части их разместился протезный завод. В 1962 году монахинь выписали из монастыря.
Флоровский монастырь выжил. Все храмы, кроме разрушенного Свято-Троицкого, возвращены монастырю. Хотя протезный завод так и не покинул территории монастыря, но Казанский собор освобождён от пошивочного производства. Сейчас его восстанавливают. Все богослужения проходят в Вознесенском соборе. Как и в былые времена, Флоровский монастырь является своекоштным необщежительным.
Сохранился действующий источник воды.
