За время своего существования церковь Св. Духа неоднократно перестраивалась. Первая православная церковь, построенная на этом месте в 1597 году, была деревянной. На ее месте в 1634 году был возведен каменный храм с главным престолом в честь Сошествия Святого Духа на апостолов и с приделами апостола Иоанна Богослова и св. равноапостольных Константина и Елены. В начале 18 века церковь, как и монастырь, была разорена шведами и затем восстановлена в 1708 году при содействии Петра I. Сгорела в пожарах 1748-1749 годов и к 1753 году опять восстановлена под руководством архитектора И. К. Глаубица. В 1814 году, при ремонте храма после бесчинств наполеоновских солдат, в склепе под алтарем были обретены мощи святых виленских мучеников Антония, Иоанна и Евстафия, которые тайно хранились там с 1661 года.
Вид, похожий на современный, церковь приобрела в 1836-1837 годах после перестроки ее под руководством полоцкого епархиального архитектора А. Порто. С 1839 года церковь вернули православным. В 1850 году под алтарем храма была устроена пещерная церковь в честь св. виленских мучеников, куда переместили их мощи. К 1873 году были осуществлены работы по устранению явных признаков стиля барокко в архитектуре церкви и колокольни, проводившиеся по инициативе виленского генерал-губернатора М.Н. Муравьева с целью придать ей более узнаваемый православный облик.
Во время Первой мировой войны (1915) мощи святых были эвакуированы в Москву, в Донской монастырь. Удалось их вернуть только в 1946 году, когда храм восстанавливался после разрушений Второй мировой войны. Архитектура храма в стиле виленского барокко имеет некоторые черты, характерные для иезуитских костелов: план в виде латинского креста, три нефа с трансептом, симметричный силуэт с двумя башнями. Первоначальный волнистый барочный фронтон между башнями и волюты были убраны в результате переделок 1873 года. Над средокрестием поднимается купол на высоком барабане, алтарная часть решена в виде трех апсид. Рядом стоит отдельная массивная колокольня в формах классицизма.
Интерьер храма украшает трехярусный барочный иконостас (арх. И.К. Глаубиц). Иконы написаны художником И.П. Трутневым в середине 19 века. Мощи св. мучеников находятся под сенью в центре храма.
