Монастырь основан в 1371 году Димитрием, игуменом Никольского монастыря в Переславле-Залесском, ближайшим последователем и духовным другом преподобного Сергия Радонежского. Димитрий принял монашеский постриг в Успенском Горицком монастыре, а вскоре, приняв сан священства, основал неподалёку Никольский монастырь «на Болоте» и стал его игуменом.
Согласно житию Димитрия, бежав от «славословия и восхваления», он покинул Переславль, взяв с собой своего ученика Пахомия. Димитрий и Пахомий двинулись на Север, в сторону «Холодного моря», и остановились недалеко от Вологды, близ селения Авнега у реки Лежи, где поставили церковь Воскресения. Однако местным жителям приход старца пришёлся не по нраву, «Если великий старец близ нас поселится, то овладеет и нами и сёлами нашими», и Димитрий с Пахомием были вынуждены двинуться дальше. Достигнув Вологды, Димитрий «увидел город, украшенный многими церквями, лишь не было здесь церкви Всемилостивого Спаса нашего Иисуса Христа на Происхождение Честного Креста и не было общежительного монастыря у иноков земли той от Волги реки и до края моря».
Постройка монастыря нашла поддержку у Дмитрия Донского. Дмитрий Донской жертвовал средства на постройку монастыря, в то время как Димитрий Прилуцкий был крёстным отцом его детей.
Первый деревянный храм будущего монастыря был освящён в честь праздника Всемилостливого Спаса, Пресвятой Богородицы, на Происхождение Животворящего Древа Креста Господня, отмечаемого 1 августа. Рядом были построены деревянные кельи для монахов.
Во время игуменства преподобного Димитрия монастырь именовался лаврой. Многие из учеников перешли из Переславля к любимому наставнику в Прилуки, и по примеру Троице-Сергиевой лавры в монастыре, впервые на Русском Севере, был введён общежительный устав. Преподобный Димитрий скончался 11 февраля около 1406 года и был погребён в деревянном Спасском соборе, у южной стены рядом с правым клиросом. Перед своей смертью, которую он предсказал, Димитрий благословил «игуменом быть моему брату и сыну духовному Пахомию».
После преставления преподобного Димитрия ему приписывается множество чудес — в основном, изгнание бесов, а также несколько чудес, когда святой являлся, чтобы помочь монастырю или городу Вологде.
В 1918 году в монастыре были проведены обыск и опись имущества, часть зданий заняли красноармейцы. В башнях монастыря во время Гражданской войны были устроены склады взрывчатых веществ, и только благодаря своевременно принятым мерам начавшийся однажды пожар не привёл к уничтожению памятника. В монастыре была организована община из жителей Прилук. С 1919 по 1923 годы в монастыре проходили изъятия церковных ценностей, в том числе в помощь голодающим Поволжья. По решению уездного исполкома архимандрит Нифонт Курсин, монахи и послушники были выселены из монастыря, протестовавшие прихожане репрессированы. Весной 1922 года жители Прилук и близлежащих деревень просили разрешения разобрать стены монастыря на кирпичи, ходатайство, однако, было отклонено.
В августе 1924 года договор с общиной был расторгнут, а монастырь закрыт. Произведения искусства были переданы в Вологодский музей, прочее имущество — различным учреждениям. В 1930-х годах в монастыре находилась пересыльная тюрьма для раскулаченных, которых перевозили в северные лагеря ГУЛага, в 1950-х — 1970-х годах он был занят под военные склады. В монастыре располагался кинотеатр, дом инвалидов. С 1950-х годов опустевшие и разрушавшиеся постройки монастыря реставрировали, при этом многим из них был возвращён предполагаемый облик XVI—XVII веков. В 1979 году монастырь стал филиалом Вологодского государственного музея-заповедника.
16 июня 1990 года, на праздник Сретения иконы Димитрия Прилуцкого, впервые после закрытия монастыря был проведён крестный ход до церкви Лазаря Праведного на Горбачёвском кладбище. В августе 1990 года церкви была передана надвратная Вознесенская церковь. В 1991 году вновь открыт мужской епархиальный монастырь. 24 февраля 1992 года, в день памяти Димитрия Прилуцкого, 600-летие преставления, монастырь был полностью возвращён Русской православной церкви. Дважды, 13—14 августа 1992 года и 16—17 июня 2007 года монастырь посещал Патриарх Московский и всея Руси Алексий II.
В последующие годы в монастыре возродилась жизнь, был осуществлён ремонт монастырских строений, восстановлены иконостасы и колокола на соборной колокольне. Ежедневно совершается полный круг богослужений. Содержится подворье и монастырская воскресная школа. В обители располагается ставленническое отделение Вологодского православного духовного училища, готовящего будущих священнослужителей Вологодской и Великоустюжской епархии. Ежегодно проводятся Димитриевские образовательные чтения, собирающие духовенство и работников просвещения.
Подворьем монастыря является церковь Димитрия Прилуцкого на Наволоке в Вологде и с 1994 по 2003 год был Свято-Троицкий Павло-Обнорский мужской монастырь в Грязовецком районе Вологодской области.
