Монастырь основан преподобным Пафнутием Боровским в 1444 году на возвышенности при впадении реки Истремы в реку Протву. История основания монастыря стала отголоском монголо-татарского нашествия: как известно, дед преподобного Пафнутия был татарином, который принял крещение в Православие с именем Мартин и положил начало благочестивому роду, из которого появился будущий «светильник» православной веры. После смерти Пафнутия игуменом монастыря стал его ученик, преподобный Иосиф Волоцкий, который вскоре, по причине нежелания братии принять общежительный устав, ушёл в Волоколамское княжество и основал новую обитель — Иосифо-Волоколамский монастырь.
На месте первой, деревянной, Рождественской церкви в 1467 году был построен белокаменный Рождественский собор (не сохранился). Роспись первого собора Рождества Богородицы Пафнутьево-Боровского монастыря является самой ранней известной работой великого иконописца Дионисия: по свидетельству жития преподобного Пафнутия, Дионисий выполнил роспись под началом старца Симонова монастыря — иконника Митрофана.
Через 117 лет, в 1586 году собор был почти полностью разобран, и на его месте по воле царя Федора Ивановича поставлен новый, пятиглавый; в кладке его фундамента использовались блоки с росписью XV века. Так фрагменты росписи Митрофана и Дионисия сохранились до нашего времени (они находятся в Центральном музее древнерусской культуры и искусства им. Андрея Рублева в Москве и Боровском филиале Калужского государственного областного краеведческого музея).
В XVI века монастырь был окружён каменными стенами и укреплениями; обитель превратилась в сильную пограничную крепость. В это время строится и каменная трапезная с храмом во имя Рождества Христова. В 1523 году была построена звонница
Духовный авторитет преподобного Пафнутия притягивал в обитель многих людей. В разное время великие князья Василий II, Иван III, Василий III, цари Иван IV Грозный, Федор Иванович, Михаил Романов и Алексей Михайлович, князья Лыковы-Оболенские, Репнины, Волконские не раз приезжали в монастырь на богомолье.
В Смутное время монастырь оказался на пути польско-литовских захватчиков во главе со Лжедитрием II и стал ареной кровавых событий, в результате которых подвиг православных защитников обители просиял в веках, а город Боровск получил новый герб. События церковного раскола, мучительно переживаемые Церковью, также коснулись монастыря — главный идейный вдохновитель старого церковного порядка протопоп Аввакум дважды содержался под стражей в стенах Пафнутьевой обители.
Расположение монастыря на пути армии «двунадесяти языков» под предводительством Наполеона в 1812 году повлекло за собой разграбление и частичное разрушение обители.
Великая Отечественная война 1941-1945 гг. также оставила след в истории монастыря: он вновь был разрушен и разграблен, но сумел выстоять и возродиться. Эпоха советского периода оказала, пожалуй, самое негативное влияние на монастырь.
После национализации обители и изгнания монахов в 1919 году, монастырь за тридцать с небольшим лет хозяйствования советской власти был превращен практически в руины.
Начавшие в 60-х годах XX века восстановление обители реставраторы столкнулись со множеством трудностей: им пришлось заливать новые фундаменты, восстанавливать стены, реставрировать храмы и здания.
Новейшая история Пафнутьевой обители началась в 1991 году с возвращения в монастырь иноков и возобновления регулярных богослужений. В настоящее время монастырь действующий. В храмах обители богослужения совершаются каждый день, возрастает число насельников обители, а также совершенствуются формы социального служения.
