Покровский женский монастырь был основан Великой Княгиней Александрой Петровной Романовой, супругой Великого Князя Николая Николаевича, третьего сына Императора Николая I.
24 января 1889 года состоялось освящение места постройки будущей обители, возникновение которой было предсказано прп. Феофилом Киевским ещё в 30-х годах ХIХ века; и уже в июле Великая Княгиня перешла сюда на жительство с первыми сестрами из Липок. Она принимала деятельное участие в созидании и налаживании жизни в обители, вложив в это все свои средства.
Монастырский городок включал в себя корпус монашеских келий, к которому примыкал храм, и двенадцать других зданий. В них располагались больница с домовой церковью, церковноприходская школа для девочек, приют для слепых и неизлечимых больных, приют для сирот и бедных детей. Были также предусмотрены бесплатная амбулаторная лечебница, аптека с бесплатной выдачей лекарств, странноприимница и многое другое.
Переехав в монастырь, Александра Петровна получила чудесное исцеление от Почаевской иконы Пресвятой Богородицы. Восприняв это чудо как знак верного выбора дальнейшего пути, Великая Княгиня желала послужить Господу в иноческом чине. Осенью того же года она, облекшись в иноческое одеяние, с которым не расставалась до смерти, приняла постриг от афонского иеромонаха, бывшего проездом в Киеве. Это оставалось глубокой тайной до её кончины. Лишь после вскрытия духовного завещания почившей узнали, что в инокинях она — Анастасия.
С этих пор Великая Княгиня стала жить согласно иноческим обетам по строгому Студийскому уставу — в ревностных молитвах и непрестанных трудах. Она избрала местом своего «послушания» и особенных забот больничные учреждения монастыря, с истинным милосердием и состраданием послужив здесь страждущим ближним. Княгиня-инокиня, которую все с любовью называли «Матушкой Великой», присутствовала при операциях, ассистируя хирургам; дежурила ночами у постели оперированных, следила за больничным распорядком, сама готовила больных к операции. Медицинские заведения обители, в которых работали лучшие медики города, отвечали последнему слову тогдашней науки и техники. Именно здесь появился первый в Киеве рентгеновский аппарат.
Монастырь разрастался, и Великая Княгиня продавала свои драгоценности, употребляя вырученные деньги на строительство любимой обители. В 1896 году в монастыре в присутствии Царской Четы был заложен новый Свято-Никольский собор. Николай II сделал на расширение больничных учреждений щедрое пожертвование, на которое были выстроены терапевтическая больница и большая лечебница для приходящих больных, ежедневно принимающая более 500 человек. Эти больничные учреждения стали называться именем Императора Николая II. Тысячи больных со всех уголков страны бесплатно получали здесь квалифицированную помощь.
В 1897 году, когда Киев был охвачен эпидемией тифа, Матушка Великая первая пришла на помощь городу, открыв в своей обители больницу для тифозных больных. До конца своих дней Княгиня-инокиня самоотверженно, неутомимо трудилась в любимом монастыре, невзирая на свои немощи и болезни, отдавая всю себя на служение ближним.
В конце марта 1900 года состояние здоровья Матушки Великой ухудшилось. Напутствованная Святыми Христовыми Тайнами она тихо скончалась в четверг Светлой Седмицы 13 апреля 1900 года на 62 году жизни. Одета почившая была в иноческое одеяние, тело положено в простой деревянный гроб, приготовленный Княгиней-инокиней ещё 10 лет назад. Согласно её завещанию, для погребения была вырыта простая яма, без сводов, напротив алтаря Покровского храма.
Монастырские больницы, которыми так дорожила царственная инокиня, после её кончины продолжали успешно функционировать. Их попечителями стали сыновья почившей: Великие Князья Николай Николаевич и Петр Николаевич. Государь Император проявил особую заботу о благотворительных учреждениях обители и повелел ежегодно отпускать из государственной казны 80000 рублей на их содержание. В 1910-1911 годах была выстроена новая большая хирургическая больница. С течением времени увеличивалось и число больных, обращающихся в монастырь за медицинской помощью.
Представители царской фамилии не забывали иноческие подвиги Великой Княгини. Находясь в Киеве по какому-либо случаю, они старались посетить созданный усопшей родственницей монастырь, побывать на её скромной могиле и почтить память почившей.
Строительство соборного храма святителя Николая продолжалось 15 лет, и 9 мая 1911 года он был освящён. Собор включал в себя верхний трехпредельный храм и нижнюю церковь в честь иконы Пресвятой Богородицы «Живоносный Источник», был увенчан 15-ю куполами. По отзывам современников, он являлся одним из лучших образцов церковного зодчества. Расписать внутри собор не успели — началась Первая мировая война.
Революционное лихолетье не минуло обитель. С 1923 года по 1941 год здесь проживали рабочие-металлисты; в обезглавленных храмах расположились детские ясли, типография, книгохранилище.
В октябре 1941 года вновь возродилась монашеская жизнь в обители. Здесь была организована амбулатория, которая в период оккупации Киева оказывала помощь оставшимся в городе жителям. Врачи амбулатории, рискуя жизнью, выдавали фиктивные справки о болезнях и тем самым спасали людей от вывоза их в фашистскую Германию на каторжные работы.
Сразу же после освобождения Киева на средства обители в монастырском здании был организован госпиталь для наших раненых солдат и офицеров. До прибытия военного персонала его обслуживали сестры, которые вплоть до конца войны продолжали работать в эвакогоспиталях, неоднократно получая благодарность за самоотверженный и благородный труд.
Монастырю была возвращена лишь третья часть его бывшей территории. Каменные здания обители отошли к государственным ведомствам, ремонт оставшихся требовал больших усилий. Несмотря на трудности, с помощью Божией были отремонтированы Покровский храм и Никольский собор, жилые монастырские корпуса.
В период довольно сложных взаимоотношений Церкви и государства Царица Небесная сохранила Свою обитель от закрытия.
В 1981 году Свято — Никольский храм пострадал от пожара, случившегося от удара молнии в крышу собора. Благодаря кирпичным сводам, самоотверженному действию пожарной команды и сестер обители, огонь не проник внутрь храма. Однако огромное количество воды повредило настенную штукатурку. После покрытия новой крыши начался внутренний ремонт собора. Одновременно, используя поставленные строительные леса, мастера-художники осуществили внутреннюю стенопись верхнего храма, которая была первой со времени его постройки.
На протяжении десяти лет по чертежам, находившимся в городском архиве, Покровский храм был перестроен из деревянного на каменный, восстановлены его купола, расписаны внутренние стены и своды. В мае 1999 года состоялось освящение этой церкви.
В начале текущего столетия были восстановлены пятнадцать куполов Никольского собора, разрушенные в атеистическое лихолетье. Ремонтные работы конструкций крыши и реставрация фасада собора продолжается.
На протяжении столетия память о трудах и подвигах преподобной Великой Княгини благоговейно передавалась из поколения в поколение. Рассмотрев житие, труды, подвиги, чудеса и учитывая народное почитание основательницы Киево-Покровского женского монастыря Инокини Анастасии Романовой, Священный Синод УПЦ 24 ноября 2009 года принял решение о причислении её к лику святых.
24 января 2010 года состоялось торжественное прославление преподобной учредительницы обители. В настоящее время рака со святыми мощами царственной подвижницы находится в Никольском соборе монастыря.
