Достоверные сведения о монастыре, в то время небольшом и малобратном, появились в середине XVI века. В позднем житии Киприана Устюжского утверждается, что обитель существовала на этом месте ещё в домонгольское время. Достоверно известно, что монастырь занимает холм Глядень, где в средние века стоял русский город Гледен, заложенный, по локальному преданию, Всеволодом Большое Гнездо.
С ростом торговых оборотов устюжских купцов в XVII веке укреплялась и Гледенская обитель. В середине XVII века на средства купцов Грудцыных и с благословения митрополита Ионы Сысоевича она начала застраиваться кирпичными зданиями. В 1697 году в Троице-Гледенском монастыре учреждено архимандритское правление. В то время основание обители приурочивали к 1492 году, «Троицкай же Гледенский монастырь, скажут, архангелские помогали строить, хлебом ссужали и людей работных посылали церковной лес ронить и возить».
Ныне существующий ансамбль монастыря сложился в конце XVII — первой половине XVIII века, сначала был построен двухстолпный Троицкий собор, по образу и подобию собора Архангельского монастыря в Устюге. затем тёплая Тихвинская церковь с трапезной, церковь Успения Богоматери и больничная палата. В XVIII веке Тихвинская церковь была соединена с Троицким собором крытой галереей. Возведение каменной ограды не было завершено из-за нехватки денег.
В 1784 году были завершены работы по созданию местными мастерами жемчужины обители, нового иконостаса в барочном стиле, длившиеся восемь лет. Образцом при его создании послужил иконостас старого собора Яковлевского монастыря в Ростове. Иконостас сохранился и знаменит своей резьбой по дереву.
Монастырь был упразднён за малобратностью в 1841 году и приписан к Михайло-Архангельскому монастырю. Вновь открылся в 1912 году в качестве женской обители.
В 1925 году упразднён. Троицкий собор с иконостасом как памятник архитектуры закреплён за музеем, остальные монастырские постройки использовались под колонию для беспризорников, детский дом-изолятор, пересыльный пункт для раскулаченных, дом инвалидов, дом для престарелых.
В начале 1980-х годов здания переданы музею.
16 июля 2014 года Епископ Игнатий Депутатов распорядился образовать архиерейское подворье «Троице-Гледенский монастырь».
