Вскоре после освящения храма Рождества Христова, преподобный Серафим призвал к себе М.В. Мантурова и сказал, «Худо мы, батюшка, с тобой сделали, ведь мы храм-то во имя Рождества Спасителя выстроили, а во имя Богородицы церкви-то у нас с тобой и нет! А Царица-то Небесная, батюшка, прогневалась на меня убогого Серафима и говорит, «Сына Моего почтил, а Меня позабыл!» Так вот что и удумал я, батюшка, нельзя ли внизу-то нам с тобою под церковью еще церковь сделать? Схлопочи-ка, батюшка, и будут у нас две церкви с тобою». Преподобный дал нитку для мерки и сказал, что если выйдет по ней подкоп под храмом Рождества Христова, то там и следует устраивать храм в честь Рождества Богоматери. Подкоп вышел как раз в раз по этой мерке. Но свод потолка был пологим и низким, и не мог держаться без опорных столбов, а церковь и без того получалась очень маленькой. Мантуров поехал за советом к преподобному Серафиму, а тот «преисполнился весь радостью неизреченною и в духовном восторге воскликнул, «Четыре столба, ведь это значит четверо мощей у нас тут почивать будут! И это усыпальница мощей будет у нас, батюшка! Во, радость-то нам какая». В 2000 году здесь действительно устроена усыпальница для святых мощей прпп. жен Дивеевских Александры, Марфы и Елены.
Строительство церкви во имя Рождества Богородицы закончилось летом 1830 года. 8 сентября храм освятил настоятель Благовещенского монастыря архимандрит Иоаким, приехавший в Дивеево, несмотря на эпидемию холеры. В церкви Рождества Богородицы иконостас был одноярусный. Он был подобен Христорождественскому, только окрашен в зеленый цвет. На Царских вратах помещалось Распятие. Храм Рождества Богородицы был теплый. В нижней церкви был очень нарядный пол из разноцветной керамической плитки, образующей живописный орнамент наподобие ковра.
После закрытия монастыря в церкви Рождества Богородицы размещался склад.
Повторное освящение нижнего храма состоялось 21 октября 1992 года. В 1993 году в церкви Рождества Богородицы прошел первый после открытия монастыря иноческий постриг.
По заповеди преподобного Серафима в церкви Рождества Богородицы постоянно горит лампада у храмовой иконы Рождества Богородицы и сестрами читается неусыпаемая Псалтирь. В 2008 году к церкви были пристроены приделы в честь Архангела Михаила и Царственных мучеников. В алтарях нижних приделов под спудом, почти на первоначальном месте их захоронения, устроены могилы Михаила Васильевича Мантурова и духовника дивеевских сестер протоиерея Василия Садовского.
Храм Рождества Богородицы расписан московским художником Константином Охотиным фресками, посвященными земной жизни Пресвятой Богородицы и истории Дивеевской обители. Приделы расписаны художниками нижегородской мастерской «Ковчег».