В 20-х годах XVI века архиепископом Макарием в новгородских монастырях был введен общежительный устав. В связи с этим, во многих монастырях строятся трапезные. Каменная трапезная с церковью троицы живоначальной в Духове монастыре построена в 1557 году по заказу игумена Ионы.
Первоначально церковь Троицы имела, вероятно, придел Николая Чудотворца, который упоминается в описи 1591 года. В описях 1582 года и 1686 года этот придел ошибочно назван самостоятельной церковью. Когда он упразднен неизвестно. В трапезной на первом этаже сначала располагались поварня, хлебня и два квасных погреба. На втором этаже — трапезная и келарская. Памятник серьезно пострадал в годы шведской оккупации, в 1611–1617 годах, а также от пожара 1685 году.
В 1812 году на верхнем этаже трапезной был устроен придел Тихвинской иконы Божьей Матери. В 1821 году в северо-восточной части верхнего этажа трапезной устроена ризница. Архиепископ Макарий, описывая церковь троицы в 1860 году, указывает, что к трапезной с западной стороны примыкает старинный каменный двухэтажный корпус, сестринский.
В XIX веке, точная дата неизвестна, трапезная и церковь подверглись частичной перестройке, центральный столб и своды верхнего этажа трапезной разобраны, над трапезным залом устроено плоское покрытие, заложены или растесаны некоторые оконные проемы, первоначальное завершение церкви переделано на четырехскатное.
Вероятно, работы велись в 20-х годах XIX века, так как известно, что в 1822 году Александр I пожертвовал 10 000 руб. на ремонт монастырских церквей. В 1910 году к югу от церкви Троицы построен новый одноэтажный каменный трапезный корпус с церковью Владимира, Михаила тверского и мученицы Наталии. Церковь Троицы Живоначальной относится к типу бесстолпных, пятиглавых, трехапсидных храмов с подцерковьем и подвалом. Подвал состоит из одного прямоугольного помещения, разделенного пополам поздней перегородкой с проемом.
Помещение перекрыто коробовым с распалубками сводом. В толще западной стены расположены две каменные лестницы. Основной объем церкви решен нетрадиционно, подпружные арки с помощью парусов поддерживают центральный барабан с невысоким сферическим сводом. Фасады памятника отличаются изящным, умеренным использованным декором. Основной декоративный мотив арки и ниши с килевидным завершением. Церковь сложена из известняковой плиты с двусторонней кирпичной облицовкой на известковом растворе.
Покрытие церкви тесовое, покрытие апсид и глав барабанов городчатый лемех, покрытие трапезной двускатное. Церковь Троицы Живоначальной представляет собой высокохудожественный образец середины XVI века. Обладает рядом композиционных, конструктивных и декоративных особенностей. Отличается стройными, удачно найденными пропорциями.
Была сильно повреждена во время Второй Мировой войны. Реставрирована в 1963 году по проекту архитектора Т. В. Гладенко.
