Монастырь основан в 1650 году по благословению Киевского митрополита Сильвестра Косова игуменом Мгарского монастыря Каллистратом, на средства 1-го Полтавского полковника Мартына Пушкаря, а также других представителей казацкой старшины и горожан. В 1695 году обитель сожгли крымчаки, в 1709 году – разорили шведы, которые, втащив сюда свои пушки, обстреливали из них город. По преданию, знаменитое пулевое ранение в ногу, – из-за которого Карл XII был скован в движениях в день Полтавской битвы, – получено королем близ монастыря, при объезде аванпостов, от казаков верных Петру. В память победы, с 1803 года архимандритам обители повелели носить на скрижалях мантии образы прп. Сампсона Странноприимца, в день его памяти произошла битва и св. вмч. Георгия Победоносца, а в 1857 году к монастырю был приписан Свято-Сампсониевский храм на поле сражения.
В 1775-1786 годах монастырь был резиденцией епископов Славянских, в 1786-1797 годах – Екатеринославских; в 1792 году здесь был погребен широко известный своими проповедями и благочестием Екатеринославский архиеп. Амвросий Серебренников, а в 1801 году – свт. Афанасий Вольховский; в 1790‑х годах в обители жил и викарий Екатеринославской епархии епископ Иов Потемкин – племянник Григория Потемкина; при учреждении в 1884 году в Полтавской епархии должности викарного епископа Прилукского, монастырь стал его резиденцией. В 1923 году обитель закрыли, в 1942 году она возродилась как женская, в 1960 году была вновь закрыта, в 1991 году – возрождена.
В монастыре началась история Славянской семинарии, созданной трудами Славянского архиеп. Евгения Булгариса: в 1778 году в обители устроили школу для подготовки монастырских певчих; в том же году ее реорганизовали в духовное училище и перевели в город, где оно в 1780 году было преобразовано в семинарию; еще до перенесения семинарии в 1798 году в Новомиргород, в ней учились основоположник новой украинской литературы Иван Котляревский, переводчик античных классиков Николай Гнедич, украинский писатель Василий Гоголь-Яновский – отец Николая Гоголя. Семинария находилась в непосредственном ведении владык Славянских, ее ректорами были архиеп. Никифор Феотоки и митрополит Гавриил Банулеско-Бодони. С 1818 года при обители существовало мужское духовное училище: до 1876 года оно находилось в подаренном монастырю помещении на склоне холма, а затем было переведено в город.
Территория обители протянулась с севера на юг, в виде узкого ромба с усеченными вершинами острых углов. Она опоясана кирпичной оградой 1-й половины 1990-х годов. В центре северного «торца» обители кольцо ограды включает 4-ярусную 47-метровую колокольню 1786 года в стиле украинского барокко, напоминающую по отделке Великую колокольню Киево-Печерской Лавры. Западнее колокольни устроены св. врата. Севернее колокольни, вне монастыря, в 1991 году сооружен памятный знак в честь монастырского некрополя, уничтоженного в советское время. На юг от колокольни, по оси монастырской усадьбы, расположены Крестовоздвиженский собор, храм Св. Троицы, храм св. прав. Симеона Богоприимца.
Крестовоздвиженский собор возведен на стыке XVII–XVIII веков в стиле украинского барокко и сочетает мотивы древнерусского, деревянного украинского и западного зодчества. Между колокольней и собором находится могила монахини Антонии Жартовской, собравшей подписи в пользу возрождения монастыря. Между собором и храмом Св. Троицы сооружена ротонда над чтимым источником.
Храм Св. Троицы построен в 1995-1999 годах на месте снесенной в советское время одноименной церкви XVIII-XIX веков, служившей, как и собор, местом погребения архиереев. В 2001 году в крипте храма погребен митрополит Полтавский и Кременчугский Феодосий Дикун.
Храм св. прав. Симеона Богоприимца соорудил в 1887 году полтавский меценат Иннокентий Котельников в память единственного сына Симеона: мальчик умер в Полтаве, когда его везли на юг для лечения от туберкулеза, и перед смертью завещал похоронить себя в Крестовоздвиженской обители, которая очень понравилась ему.
Вдоль западной части ограды обители, напротив собора, протянулся корпус келий 1770 года постройки, поновлявшийся в 1863 и 1892 годах. Южнее, напротив храма Св. Троицы, имеющего статус прихода, в 1990-х годах выстроен дом приходской Свято-Троицкой общины. Еще южнее, также вдоль ограды, тянется корпус келий, сооруженный в 1889 году Иннокентием Котельниковым, с домовым храмом прп. Серафима Саровского 1-й половине 1990-х годов. Кроме указанных зданий, в южной и восточной частях монастырской усадьбы находится несколько хозяйственных строений.
