Первый Успенский храм появился в Одессе спустя 20 лет после основания города. Небольшая старообрядческая часовня была освящена 7 июля 1814 года. В 1845 году был утвержден план строительства трехпрестольного Свято-Успенского храма, а 8 лет спустя в 1853 году сюда впервые внесли одну из главных святынь Юга царской России – чудотворную «Касперовскую» икону Божьей Матери. В 1854 году именно она защитила город от англо-франко-турецкого флота, который зашел в одесский залив.
17 июля 1855 года святитель Иннокентий заложил новый трехпрестольный Успенский Храм на Преображенской. Основные средства на строительство церкви выделили одесские купцы Черепенниковы. Архитектором нового храма стал Л. Оттон.
На строительство храма ушло 14 лет — 12 апреля 1869 года архиепископ Херсонский и Одесский Димитрий освятил здание собора.
19 января 1875 года архиепископ Херсонский и Одесским Леонтий освятил главный придел нижнего единоверческого храма во имя святителя и чудотворца Николая – покровителя моряков и путешественников, а 30 января – и второй придел — во имя Трех Святителей: Василия Великого, Григория Богослова и Иоанна Златоуста. Через некоторое время жители Москвы пожертвовали на нижний храм Одесской Свято-Успенской церкви иконы и богослужебную утварь.
В нижнем храме Свято-Успенского кафедрального собора находятся мощи праведного Ионы, явившего, по словам современников, множество различных образов святости. Отец Иона обладал даром пророчества и целительства душевных и телесных ран. Крест, которым он святил воду, до сих пор хранится в соборе и является одной из наиболее почитаемых в народе святынь.
Также, в Свято-Успенском кафедральном соборе Одессы находится икона святителя Иннокентия с частицей его мощей.
Нелегко пришлось Успенскому собору, как, впрочем, и другим храмам города, с приходом большевиков. Храм был закрыт в конце 30-х годов XX века.
В 1942 году румынские оккупанты возобновили деятельность нижнего храма. Для этого им, правда, пришлось несколько дней откачивать из него воду – храм был затоплен на 1,5 метра. Во время Великой Отечественной войны верхний храм пострадал гораздо больше нижнего, в центральный купол угодила немецкая бомба. Вместе с тем 56-метровая колокольня храма стала одним из символов борьбы одесситов с фашистскими оккупантами. Одна из историй гласит, что однажды ночью советские подпольщики водрузили на колокольню красный флаг, который румынам удалось снять только следующим вечером. Когда-то об этом событии указывала соответствующая мемориальная доска на стене храма.
Огромную роль в восстановлении храма после войны сыграли архиепископ Никон, митрополит Борис и патриарх Алексий I Симанский.
В 2008 году по инициативе и благословению митрополита Одесского и Измаильского Агафангела произведен капитальный ремонт здания, усовершенствована система отопления, после чего храм украсили новыми настенными росписями. Проектировщиками росписи Верхнего храма стали Владимир Борисов и Ростислав Антонов. Сами росписи выполнены художниками — Виталием и Даниилом Хомницкими. Так же стараниями Владыки Агафангела была благоустроена воскресная школа. В 2010 году по благословению Владыки был позолочен купол над колокольней, а в 2012 году – главный купол.
