Из писцовых книг Ново-Александровой слободы 1675 года, «в городе ж в осыпи девичь монастырь Успения Пресвятые Богородицы, а на монастыре церковь Успения Пресвятые Богородицы каменная с трапезою да предел Марии Египецкие». Направо от южного входа в обитель расположена небольшая Успенская церковь, давшая название всему монастырю. Построенная в начале XVI века, по другой версии, в 70-х годах XVI века, она служила домовой великокняжеской церковью. Кроме основного престола в честь Успения Божией Матери, имела два придельных, северный Николая Чудотворца, и южный Иоанна Крестителя. Построенная из белого камня и кирпича, изначально церковь Успения была четырехстолпной, одноглавой, трехапсидной, возвышалась на высоком подклете, под которым находились хорошо сохранившиеся до нашего времени белокаменные погреба. Расположенные с трех сторон открытые галереи во 2 половине XVI века были заложены кирпичом. Сейчас это пятиглавый храм. Пристроенные позднее четыре главки были сделаны глухими, без окон, их барабаны перетянуты двумя валиками. Кресты на чешуйчатых главах завершаются украшениями в виде венцов. Облик церкви отчасти искажен его четырехскатным покрытием, сделанным, по всей видимости, в XVIII веке Колокольня храма приземиста, шатер ее поставлен на четверик, грани последнего прорезаны открытой аркадой. Двухъярусные каменные паперти частично были восстановлены архитектором Н.В. Сибиряковым в подклете здания. Фрагмент верхнего яруса галереи раскрыт в интерьере церкви, на южной стене Иоанно-Предтеченского придела. Можно увидеть первоначальные белокаменные резные порталы Успенской церкви, южный раскрыт полностью, северный частично. Западный портал, вероятно, был растесан при перестройке.
В самом начале XVII века, в период Смуты, церковь значительно пострадала и до середины века службы в ней не было. В 1651 году указом царя Алексея Михайловича Успенская церковь, «что в буграх», была передана для устроения девичьей обители. Монастырская летопись сообщает, «И тая церковь от разорения была пуста, и запорошена и не освящена И старицы Анисия и Феодора святую церковь очистили и иконы измыли и все добре устроили». На пожертвованные «ради всемирныя радости» о рождении Царевича Алексия Алексеевича Царицей Марией Ильиничной 40 рублей «иконы починили и церковь украсили». Обновленный храм был освящен по благословению Патриарха Никона преподобным Лукианом 15 августа 1654 года в праздник Успения Пресвятой Богородицы.
В 1663-1666 годах, при новом духовнике обители, старце Корнилии, Успенская церковь была значительно перестроена, в четверике переложили свод, разобрали два западных столба для увеличения объема церкви и сделали вместо одной главы, венчающей церковь, пять. Одновременно с запада была пристроена трапезная с хлебной и поварней под ней, к которой вскоре была «приделана колокольня каменная, на ней восемь колоколов да часы железные проведены к тем же колоколам». Несколько позднее пристроили с севера двухэтажную сводчатую палату на основании старых дворцовых палат. Производили все эти работы «государевы мастера», присланные Царем Алексеем Михайловичем и Царицей Марией Ильиничной по ходатайству благодетелей монастыря боярина Ф. М. Ртищева и его сестры А. М. Вельяминовой. Бывший придел святого Николая Чудотворца был освящен во имя преподобной Марии Египетской, небесной покровительницы Царицы Марьи Ильиничны. Монастырская опись 1675-1676 годов гласила, “Церковь каменная, старая, во имя Успения Пречистые Богородицы починена, своды в олтаре и в церкви сделаны новые, престол и жертвенник, и мост переделаны на ново, да по стороне де тое церкви зделана у них другая церковь предельная, каменная, во имя Марии Египетские, на старом основании вся новая”. В 1667 году, после большой перестройки, Успенский храм заново был освящен, о чём свидетельствовала надпись на кресте, «Освятися сей алтарь Господа нашего Иисуса Христа во храме Пресвятыя Богородицы честнаго и славного ея Успения в девиче монастыре, что в Александровой слободе, лета 1667 августа в 14-й день при Благоверном Царе и Великом князе Алексее Михайловиче всея Руси, при Патриархе Иоасафе втором, при Духовнике Строителе иеромонахе Корнилии, при игумении Анисии».
В 1743 году на деньги, выданные из Коллегии Экономии, заменили обветшавшие тесовые крыши, заново опаяли жестью главы церкви. В 1755 году для укрепления сводов были заложены арки в подвалах. В конце XIX века — начале XIX века слюдяные окна церкви были заменены «российскими стеклами», тесовые крыши покрыты «сибирским железом», а ветхие штучные шахматные дубовые полы заменены «гжельской лешадью» плиткой. Большие ремонтные работы в XIX веке проводились в Успенской церкви игумениями Евгений Ивановой, Елисаветой Лавровой, Евфрасией Лихаревой. В 1869 году церковь была обновлена на средства московского купца А.М. Полежаева и его зятя александровского купца В.П. Зубова в память о рано умершей дочери Полежаева Анне. На пожертвование его дочери Клавдии Алексеевны Зубовой в 1900 году была окрашена крыша храма и главы, которые распестрили разными красками, как было прежде. Успенский храм был теплым, отапливался замечательно украшенными изразцовыми печами, и в нем круглый год совершались ранние литургии. В нижнем этаже церкви располагались монастырские квасоварня и просфорня. В храме находились 2 чудотворные иконы Божией Матери середины XVII века, образ Успения, с 1961 года хранится в запасниках фонда древнерусского искусства Владимиро-Суздальского музея-заповедника в городе Суздале и Страстная икона, в наши дни находится в Троицком соборе. Привезенную из Иерусалима в 1887 году Любовью Михайловной Соболевой икону Успения Божией Матери, украсив окладом с вызолоченным сиянием, поместили над царскими вратами Успенской церкви. По воскресеньям, во время торжественных молебнов, святую икону спускали, чтобы верующие могли приложиться к ней. Особой святыней Успенской церкви, привлекавшей богомольцев, был позолоченный ковчег с частицами святых мощей многих угодников Божиих, у которого дежурила одна из монахинь.
Когда в феврале 1923 года монастырь был закрыт, прихожане, зарегистрировав религиозную общину, отстояли Успенскую церковь, и в ней продолжались богослужения, но не долго: после Пасхи, в мае, храм отобрали у верующих и передали Александровскому историко-бытовому музею. Посетивший в 1927 году Александров, В.П. Зубов с горечью описывал, что Успенский храм «имеет заброшенный, покинутый вид. Для осмотров он закрыт, здесь хранятся неразобранные музейные вещи, помещены реставрируемые, еще не окончательно расчищенные иконы».
В настоящее время Успенская церковь находится в ведении музея-заповедника «Александровская слобода».
