Храм, расположенный на третьем этаже семинарии, расписывали московский художник Чередников с помощниками и оренбуржец – известный русский художник Лукиан Попов. На стенах изображены в полный рост святители. Против алтаря над аркой – торжественный Вход Господа Иисуса Христа в Иерусалим. 26 августа 1884 года однопрестольный храм во имя трёх святителей – Василия Великого, Григория Богослова и Иоанна Златоуста – был освящён епископом Вениамином II, отслужившим в нём и первую Литургию. В учебную церковь поступило много пожертвований. Один из благотворителей, пожелавший скрыть своё имя, сделал на Богородичную икону серебряную ризу с золотым венцом с семью камнями: три бриллианта и три розовых рубина. Он же пожаловал на храм колокол в 20 пудов. Игуменья Оренбургского Успенского монастыря Таисия преподнесла серебряный потир, смотритель духовного училища Николай Сперанский – аналой к престолу с вышитым покрывалом, председатель строительного комитета, священник оренбургской Троицкой церкви Иоанн Разсыпнинский, служил в войсковом Георгиевском соборе, в Покровской церкви села Ташла, несколько икон. И много других пожертвований приняла Трёхсвятительская церковь от своих благотворителей.
1917–1918 учебный год был последним в семинарии – здание заняли части Красной армии. Впоследствии здесь разместилось Чкаловское лётное училище, переведённое из Серпухова, с 1995 года – муниципальный кадетский корпус имени И.И. Неплюева. Упорным ходатайством Высокопреосвященного Валентина, митрополита Оренбургского и Бузулукского, часть здания семинарии была возвращена епархии, на основании решения Оренбургского горсовета от 15 июня 2007 года. После реставрации в нём открыта Оренбургская духовная семинария. Исчезнувшие росписи храма восстановлены по первоначальным эскизам, сохранившимся в Российском государственном историческом архиве. Расписывать восстановленный храм пригласили мастеров Палехской иконописной мастерской «Лик», поселок Палех Ивановской области. Руководитель группы художников Олег Романович Шуркус перед росписью храма оренбургской семинарии ездил на Афон. В марте 2010 года иконописцы начали работы в храме с потолка трапезной, в сентябре приступили к росписи центральной части, с марта 2011 года – завершение работ в притворе.
В алтаре церкви находится старинная икона «Моление о чаше», работа известного русского художника Владимира Егоровича Маковского, переданная из Покровского собора, ранее находившаяся в оренбургском Казанско-Богородицком соборе, Казанская икона Божией Матери, в металлической ризе, икона святителя Николая, Мирликийского Чудотворца, написанная орским иконописцем протоиереем Сергием Барановым, передана епископом Орским и Гайским Иринеем.
Вся деятельность семинарии строится вокруг храма – сердца семинарии. Здесь ежедневно совершаются уставные богослужения, чтение молитвенных правил для студентов, сюда может прийти каждый желающий, чтобы помолиться. В 2014 году семинария отметила юбилейную дату – 130-летие со дня своего основания.
