Свято-Троицкая церковь была из первых временных церквей четвёртой по счёту, после Успенской соборной, Воскресенской госпитальной и Никольской казачьей. Построенная и освящённая в 1740 году на первый случай для Пензенского полка, «в 1745 в Оренбург была перенесена из Самары, где до 1743 года находился центр управления Оренбургским краем». В 1744 году Троицкая стала военной церковью для переведённого из Уфы батальона Нижегородского полка. Сначала она была также деревянной, а потом в 1781-1786 годах перестроена заново в каменном виде. Из четырёх первых церквей только Троицкая сохранялась до советского периода. Другие же церкви прекратили своё существование: Успенская – в 1758 году с устройством взамен её Введенского каменного собора; Никольская – за сгоранием в 1786 году, а Воскресенская – за крайнею ветхостью и по случаю устройства в 1770 году взамен её Крестовоздвиженской церкви, перенесённой из упразднённой Воздвиженской крепости.
Каменная Троицкая церковь начата была строительством в 1774 году на казённый счёт и на пожертвования горожан в память освобождения от полугодовой осады Оренбурга отрядами пугачёвского войска. По недостатку средств у прихожан после длительной и чрезвычайно бедственной осады города строительство церкви продолжалось восемь лет. Освящена она была по завершении строительства в 1783 году. Здание церкви неоднократно повреждалось во время городских пожаров, особенно 1786 и 1879 годов. Колокольню к церкви пристроили в 1807 году. В 1828-м году были сооружены два придела: правый в честь Успения Пресвятой Богородицы, левый во имя святителя Николая Чудотворца, т.е. приделы воздвигли в память исчезнувших первых церквей – Успенской и Николаевской, главный же престол посвящён «имени Святыя Живоначальныя Троицы».
В 1876 году на личные средства старосты церкви мещанина Григория Пожарского храм «обнесли чугунной оградой, основанной на широком фундаменте из местного гребенского камня, решётка которого отделялась чрез каждые четыре аршина каменными столпами: установили двое ворот, северные и южные, на обоих углах ограды северных ворот устроены были две небольшие лавки».
После пожара 1879 года храм восстанавливался на пожертвования, частью собранные прихожанами, частью по подписке в разных городах России. Особенно деятельное участие в сборе пожертвований приняли известный благотворитель того времени купец Иван Шибаев, а также служители этой церкви: настоятель протоиерей Матвей Любочестнов, священник Иоанн Вицинский и церковный староста Иван Сачков. Помощь церкви оказали купцы Зарывновы, Мошковы, Ванюшины, Рыжковы, наибольшие вклады сделали братья Сачковы и Михаил Моталев. На пожертвования купцов Василия Мякинькова и старосты Ивана Сачкова появился позолоченный иконостас, в котором установлено было 22 иконы, из них четыре наиболее ценные – работы Московской академической школы живописи. По возобновлении, 21 марта 1882 года, церковь была освящена. Украшали храм вызолоченные купола, маковицы и кресты. В ограде вокруг церкви росли высокие вётлы, акации, дубы и густая сирень. У ограды хоронились почётные лица города.
Церковь после реставрации вмещала до полутора тысяч прихожан. Стояла она на небольшой площади близ рыбных лавок главного рынка и дома княжны Имеретинской. Южной стороной церковь выходила на Неплюевскую улицу, где напротив церкви располагались городские женские учебные заведения – гимназия и прогимназия. В 1892 году прихожане церкви воздвигли на рынке часовню, приписанную к храму, о пяти главах в память чудесного спасения царского семейства 17 октября 1888 года при крушении железнодорожного поезда. При церкви имелся дом с квартирами для неимущих.
