Впервые деревянный храм упоминается в писцовых книгах за 1629 год, где он называется церковью Великомученика Никиты и Святителя Алексия. Иногда к её наименованию прибавлялись уточнения, «что у Дедиловских ворот», имеются в виду ворота острога, или «что на посаде». В XVIII веке она называлась церковью великомученика Никиты, «что слывет старою», в отличие от Новоникитской, или Сретенской церкви на углу улиц Пятницкой, сейчас это улица Металлистов и Посольской, сейчас это улица Советская. К середине XVIII века храм сильно обветшал. Были перестроены трапезная, колокольня и придел Алексия митрополита. В 1758 году купец Иван Фомич Лугинин устроил с правой стороны трапезной ещё один придел во имя священномученика Харлампия. В 1779 году церковь «в стенах, окнах и дверях была поправлена» и освящена в 1789 году. В 1820 году одноэтажную Староникитскую церковь разобрали до основания и выстроили вновь уже в два этажа. Нижний храм был освящён в 1821 году, верхний в 1827 году, во имя иконы Божией Матери «Живоносный Источник». В 1850—1851 годах усердием церковного старосты А. И. Жданова был изготовлен новый главный иконостас во имя иконы Божией Матери «Живоносный источник». В 1852 году в трапезной на втором этаже по завещанию купца Михаила Ивановича Струкова был выстроен придел во имя Архистратига Михаила. Колокольню построили вполне качественно ещё в 1755 году. Правда, через сто лет с её шпиля, главки и креста «от продолжительного времени» исчезла позолота. Прихожане решили возобновить её, а также позолотить большой купол над основным объёмом храма и два малых над приделами. Все это было сделано в 1863 году тщанием церковного старосты купеческого сына Михаила Михайловича Струкова и «первостатейных прихожан». На колокольне имелось 7 колоколов. Иконостасы верхнего и нижнего храма были позолочены на деньги того же М. М. Струкова и ещё нескольких купцов. Жертвователи потратили на благое дело более пяти тысяч рублей. Из всех образов церкви наиболее чтимой была икона Божией Матери «Живоносный Источник». По преданию, она висела когда-то на воротах дома купцов Лугининых, потом им владели купцы Плаховы, позже там находилась мужская гимназия; ныне это один из корпусов Тульского государственного педагогического университета. Эта икона прославилась в городе своими чудесами. В начале XIX века она находилась в доме купцов, а впоследствии мещан Ивана и Петра Алексеевичей Лугининых. К образу приходили молиться «посторонние люди». Одно из чудес того времени, исцеление от слепоты купца Якова Ивановича Бабаева. Говорили, что вследствие усердных молитв перед иконой исцелилась от водянки мать Ивана и Петра Агриппина Ивановна Лугинина. Перед смертью она завещала передать чудотворный образ в Староникитскую церковь, что и было сделано в 1818 году. Нередко эту икону целыми днями носили по домам горожан, а в праздники храм не вмещал всех желающих помолиться перед ней. Поэтому, когда церковь была возведена заново и стала двухэтажной, во имя этой иконы Божией Матери «Живоносный Источник» освятили верхний храм.
В 1894 году при храме была открыта церковноприходская школа. Вначале она существовала в доме, купленном за 950 рублей у наследников умершего протоиерея Староникитской церкви Любомудрова. Но дому этому было более ста лет, он грозил обрушиться со дня на день. В 1902 году церковноприходское попечительство приняло решение о постройке для школы нового дома. И за два следующих года двухэтажная школа была построена. В 1903 году в ночь под храмовый праздник великомученика Никиты в Староникитской церкви случился пожар. Сгорел иконостас верхнего храма и купол. На восстановление требовалось более тысячи рублей. Денег не было ни в церкви, ни у церковноприходского попечительства. Когда же рабочие осмотрели кровли храма и колокольни, выяснилось, что они во многих местах проржавели, нуждались в замене и водосточные трубы. На это требовалось много железа, а купить его было не на что. Ремонт приостановился на полгода. Тогда член попечительства Н. А. Зубарев, человек небогатый и не имевший средств на приобретение железа для пожертвования его храму, с согласия своего хозяина Щелкина отпустил заимообразно в церковь необходимое количество железа. По храму получили название сразу две тульские улицы, на пересечении которых он стоял. Одна из них, ведущая к Упе, называлась Никитской, другая, идущая к юго-восточной окраине города, Староникитской.
Храм был закрыт по постановлению президиума Мособлисполкома от 16 февраля 1930 года. Первоначально предполагалось использовать его здание под школу, внутри можно было разместить до восьми классных комнат, «то есть организовать новую школьную единицу». Однако бывший храм почти сразу же после закрытия был передан создаваемому в то время и нуждавшемуся в площадях Тульскому механическому институту для размещения лабораторий и учебно-производственных мастерских. Эти лаборатории находились в здании бывшей церкви почти 65 лет. Позже появились и другие арендаторы, например, подразделение Института физики Земли, занимавшееся поверкой измерительных приборов для подводных лодок. В 1991 году здание храма было поставлено на госохрану в качестве памятника истории и культуры регионального значения. В сентябре 1994 года в газете «Молодой коммунар» была опубликована статья А. Юрьева под названием «Итог десятилетней борьбы», в которой говорилось о выдворении из здания бывшего Староникитского храма и Института физики Земли, и политеховских лабораторий. В освободившихся помещениях разместился муниципальный театр-студия «У Толстовской заставы». В будущем, по сообщению «Молодого коммунара», здесь же предполагалось открыть выставочный зал, при котором действовала бы школа иконописи. Победа оказалась пирровой, новым арендаторам не удалось сохранить бывший храм до лучших времен. Иконописную школу так и не создали. В 1995 году рухнуло красивейшее чугунное крыльцо при входе в храм, а в 1998 году в помещении театра произошел сильный пожар. Были разрушены перекрытия и кровля здания. Ремонт бывшей церкви после пожара не проводился. Сегодня здание не используется и постепенно разрушается. Никитская церковь входит в состав казны муниципального образования город Тула, однако не может быть отреставрирована за счет средств бюджета, поскольку является имуществом религиозного назначения.
