Относительно времени построения Златоустинской (Мироносицкой) церкви существуют различные сведения. Некоторые авторы относят церковь к началу XVIII века, другие считают, что этот храм мог быть построен и в XVI веке. По Клировым ведомостям, это храм XVII века, но точный год его постройки не указывается.
Эта своеобразная церковь располагается на углу Набережной VI армии и улицы Энгельса, ранее благодаря храму именуемых Златоустинскими.
В архитектурном отношении храм Иоанна Златоуста имеет прямые аналоги в монастырском зодчестве, в частности, подобная церковь имеется в Спасо-Прилуцком монастыре (теплая церковь Введения во храм Пресвятой Богородицы, вторая по-ловина XVI — XVII век).
Двухэтажный Златоустинский храм по своему живописному объемному построению близок церкви Константина и Елены: двусветный куб на подклете, также завершенный пятью крупными куполами глав, с пониженными прямоугольными пристройками — алтарем и папертью, и колокольней у северо-западного угла. Звонница — самая удачная и типичная часть храма. На широкий мощный четверик поставлен сравнительно узкий восьмерик звона, покрытый пирамидальным каменным шатром со слуховыми окнами, идущими в два ряда, и завершенным главой. Характер кладки, лепки стен и форм ее украшений подтверждает подлинность предположения о сооружении колокольни до XVIII века.
Церковь является одним из первых двухэтажных храмов Вологды со времени начала их построек. Златоустинская церковь состояла из двух помещений: нижней и верхней церкви. Таким образом, в этом храме полностью отразилась идея преемственности двойных вологодских церквей, холодной и теплой, объединенных в одном здании. Престол верхней церкви был освящен во имя Иоанна Златоуста, престол нижней церкви — во имя Жен Мироносиц.
В начале XX века Златоустинская церковь была упразднена, а в Советское время закрыта.
В начале 2000-х годов церковь возвращена верующим. Храм являлся приписным к церкви Покрова на Торгу.
В 2010 году были возобновлены работы по реконструкции храма. Восстановление велось под контролем Департамента культуры и охраны объектов культурного наследия Вологодской области.
Согласно указу от 25 июня 2014 года, епископа Вологодского и Великоустюгского Игнатия 25 июня 2014 грда был образован приход храма святителя Иоанна Златоуста Вологды Вологодской епархии Русской Православной Церкви, Московский Патриархат, настоятелем храма назначен иерей Алексий Калин.
